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解决方案丨植物叶中内源性细胞分裂素的固相萃取新方法发表时间：2025-06-20 13:29 植物激素作为植物体内的信号分子，几乎调控着植物体从胚胎形成到衰老的 整个生长发育的方方面面。由于植物激素具有不同的化学结构和化学性质，在植物体内的含量极低，往往在nmol水平，因此相对于转录组学和蛋白组学分析， 对植物激素的精确分析更加困难[1] 。了解细胞分裂素这些重要作用，对促进农业发展有重要意义。同时也有文献报道，一些细胞分裂素对动物体表现出抗肿瘤，抗血栓的作用[2] 。因此，深入了解细胞分裂素的功能，对哺乳动物的疾病治疗也有潜在意义。 串联质谱因其分析快速、灵敏度高，已经成为细胞分裂素定量分析的有力工具。为了实现灵敏检测，在质谱分析之前，需要经过适当的样品前处理对细胞分裂素进行提取和富集[3]。对于复杂植物样品中的细胞分裂素进行分析，单一的步骤往往不足以达到检测系统的技术要求，通常需要多种SPE技术的组合。由于每个步骤所用的材料不同，上样要求也有差异。因此，常常需要将植物提取液和上个步骤的解吸液浓缩后再进行重新溶解以满足下一步骤上样的需要，这使得前处理过程冗长、耗时。 样品前处理 鲜重为0.5 g的植物样品在液氮中研磨成粉状，加入2.5 mL提取液（Bieleskibuffer：甲醇/水/甲酸，15/4/1 ，V/V/V）和1 ng稳定同位素内标[2H6]iP, [2H6]iPR, [2H6]iP9G, [2H5]t-Z, [2H5]t-ZR, [2H5]t-Z9G, [2H3]DHZ, [2H3]DHZR（具体结构见图1），于-20 ℃提取过夜（12 h）；冷冻离心（ 10000 rpm, 20 min），取出上清液。 将上清液通过LUJACap C18 200mg/6mL 固相萃取小柱（预先以3 mL甲醇和3 mL Bieleski buffer活化）以除去大部分色素和酯类物质，流出液无需浓缩和重新溶解，直接通过预先用2 mL甲醇和2mL Bieleski buffer活化过的混合模式萃取小柱，接着用2 mL甲醇清洗，再用3 mL解吸液（丙酮/氨水，100/10，V/V）解吸，用5mL离心管收集解吸液，于35 ℃下氮气吹干后用流动相定容至100 μL，取10 μL进入HILIC-MS/MS 系统进行分析。示意图见图2。  图1. 细胞分裂素化学结构式  图2. 细胞分裂素的样品前处理步骤 色谱条件 色谱柱：LUJASep SiO2 (2.0 mm×250 mm, 5 μm) 流动相：乙腈：0.01%甲酸水溶液 = 85 : 15（v/v） 流速：0.2mL/min 柱温：35℃ 质谱条件：以[M+H]+母离子和相应的子离子在多反应监测(MRM)模式下对分析物进行定量。 气帘气：27 psi 离子源电压：5400 v 加热辅助气温度(TEM)：540 ℃ 雾化气(Gas1)：49 psi; 加热辅助气(Gas2)：42 psi 其他条件如母离子、子离子质荷比(m/z)，去簇电压(DP)，碰撞能量(CE)，入口电压和碰撞池出口电压见表1。 表1. 细胞分裂素的MRM参数  混合模式固相萃取条件的优化
图3. SPE吸附剂用量对细胞分裂素回收率的影响 由于细胞分裂素的提取液为 Bieleski buffer（甲醇/水/甲酸，15/4/1 ，V/V/V），其中高比例的甲醇和甲酸均可能会影响混合模式萃取柱的萃取效率。因此，课题组分别考察了在保持甲酸或甲醇含量不变的情况，相应改变溶液中甲醇或甲酸的比例由图4和图 5可以看出，在整个考察范围内，萃取材料对几种细胞分裂素都表现出很强的萃取能力。  图4. SPE上样溶剂中甲醇含量对细胞分裂素萃取效率的影响  图5. SPE上样溶剂中甲酸含量对细胞分裂素萃取效率的影响 采用不同批次的LUJACap MCX，考察了同一批次内和不同批次间材料对细胞分裂素萃取的重现性，结果见表2 。 此外，课题组还对比了纯硅胶与LUJACap MCX对细胞分裂素的萃取效果。如表3 所示，未键合的硅胶对细胞分裂素几乎无萃取效果，而LUJACap MCX对8种细胞分裂素的萃取效率达到了 83.5% 以上。进一步说明了硅胶基质的混合型阳离子交换柱吸附介质对细胞分裂素有良好的萃取效果。 表2. 考察LUJACap MCX材料对细胞分裂素萃取的重现性  表3. 考察硅胶和LUJACap MCX材料对细胞分裂素的萃取效率  将八种细胞分裂素的混合标样依次配成 0.1-500 ng/mL浓度的溶液，每份中加入[2H6]iP, [2H6]iPR, [2H6]iP9G, [2H5]t-Z, [2H5]t-ZR, [2H5]t-Z9G, [2H3]DHZ, [2H3]DHZR 八种同位素内标各1 ng。采用串联质谱MRM 模式定量，以八种细胞分裂素的峰面积与相应同位素内标峰面积的比值对标样的浓度进行线性回归，得到线性回归方程及相关系数。结果见表4，几种细胞分裂素在0.1-500 ng/mL 浓度范围内工作曲线线性良好，相关系数优于0.9970。以信噪比3:1 和10:1 分别计算得到检出限和定量限，其检出限介于0.00049-0.012 ng/mL，定量限介于0.0016-0.039 ng/mL，完全可以满足实际分析需要。 表4. 八种细胞分裂素的线性数据  课题组在拟南芥样品中添加低、中、高三个浓度的细胞分裂素（1 ng/g，5 ng/g，10 ng/g），计算方法在日内和日间的相对标准偏差（RSD）和回收率来评价其精密度和准确度，结果见表5 。一天内分别对添加三种浓度的待测样品重复分析 6次，测得细胞分裂素的峰面积与同位素内标峰面积比值的日内RSD 小于 5.7 %。连续三天对添加不同浓度的待测样品进行分析，测得的待测物峰面积与同位素内标峰面积比值的日间RSD小于 9.7%。说明该方法有较好的重现性。通过上述测定结果，计算低、中、高三个浓度下该方法的回收率，八种细胞分裂素的回收率在 89%-113%之间。说明该方法有较好的准确性，可靠实用，适用于植物样品中细胞分裂素的检测。 表5. 该方法的日内、日间精密度和准确度  拟南芥中内源性细胞分裂素的多反应监测色谱图见图6。
 图6. （A）在HILIC模式下分离的30 ng/mL 细胞分裂素标准品的MRM色谱图 （B）拟南芥中检测到的细胞分裂素的MRM色谱图 采用LUJACap C18 和LUJACap MCX 组合，成功建立了一种简单、快速的固相萃取新方法用于定量分析植物组织中的内源性细胞分裂素。和文献中的其他方法相比，该混合模式固相萃取柱由于其上样溶液可与植物提取液匹配从而无需浓缩再溶解步骤，可实现对细胞分裂素的快速萃取，并得到较高的回收率（绝对回收率>80%）。此方法可极大缩短前处理时间，实现快速、高效、高通量的萃取，为植物激素的快速检测奠定了一定基础。 参考文献 [1] M. Kojima, T. Kamada-Nobusada, H. Komatsu, K. Takei, T. Kuroha, M. Mizutani, M. Ashikari, M. Ueguchi-Tanaka, M. Matsuoka, K. Suzuki, H. Sakakibara, Highly sensitive and high-throughput analysis of plant hormones using MS-probe modification and liquid chromatographytandem mass spectrometry: an application for hormone profiling in Oryza sativa. Plant Cell Physiol., 2009, 50, 1201-1214. [2] K. Vermeulen, M. Strnad, L. Havlcěk, H. Van Onckelen, M. Lenjou, G. Nijs, D. R. Van Bockstaele, Z. N. Berneman, Plant cytokinin analogues with inhibitory activity on cyclin-dependent kinases exert their antiproliferative effect through induction of apoptosis initiated by the mitochondrial pathway: Determination by a multiparametric flow cytometric analysis. Exp. Hematol., 2002, 30, 1107-1114. [3] K. Hoyerova, A. Gaudinova, J. Malbeck, P. I. Dobrev, T. Kocabek, B. Solcova, A. Travnickova, M. Kaminek, Efficiency of different methods of extraction and purification of cytokinins. Phytochemistry, 2006, 67, 1151-1159. 如有侵权请联系作者删防 转载请在下方留言或联系后台工作人员 以上出现的鹭珈产品，欢迎咨询：  厦门鹭珈聚芯生物科技有限公司，致力于色谱填料微球的产业化与稳定同位素试剂开发，以全球领先的“超高效”灌流硅胶微球和单分散、全介孔硅胶微球、稳定同位素试剂三大产品系列为核心，公司拥有从原料单体生产硅胶微球、先进的表面键合修饰工艺、分析色谱柱、半制备柱和制备纯化填料生产的完整产业链，为生物医药、生命科学、食品安全、环境化工等行业提供高品质、高性价比的产品和服务。公司拥有解决“卡脖子”问题的关键核心技术——微球的可控制备及量产，已开发单分散、全介孔硅胶微球，产品种类包含 C18、C8、苯基、氨基、二醇基、手性、GPC/GFC等。 公司已经获得ISO 9001:2015 质量管理体系认证，已取得发明专利2项、实用新型专利5项，在申请发明专利3项，实用新型专利 3项，已获批16 个注册商标。 |
