化学标记-液相色谱质谱联用技术概述发表时间：2024-12-27 09:00 目前，液相色谱质谱联用技术（LC-MS）因其具有分离能力强、灵敏度高、选择性强的优点，已成为代谢组学分析的重要工具。然而，某些化合物本身缺乏易电离基团，质谱响应弱，含量低，稳定性差，因此用LC-MS难以检出。化学标记 (chemical labeling，CL) 通过对分析物引入“修饰”基团，能够在一程度上解决上述问题，从而扩展LC-MS的应用范围。具体包括以下方面：  一般来说，引入永久正电荷或易质子化官能团 (-N, -N+ ) 可提高分析物在正离子模式下的离子化效率[1]。例如Liu等人[2]以ω-bromoacetonylquinolinium bromide (BQB) 标记水稻中的植物螯合肽 (phytochelatins, PCs) 图1)。经BQB标记后，分析物的灵敏度提高了14-750倍。
图1.Labeling reaction of BQB and PCs [2] 通过化学标记引入易断裂位点，能够对特征子离子进行预测，从而构建MRM分析方法，提高检测灵敏度。Liu等人[3]利用BQB标记巯基化合物。经BQB标记的巯基化合物在CID下能产生m/z 218的特征子离子碎片。以筛选到的BQB-巯 基化合物的母离子和特征子离子m/z 218为MRM离子对通道(图2)，对巯基化合物进行定量分析。经比较，MRM模式的检测灵敏度相较于中性丢失模式提高了2.1-11.3倍。
图2.LC-MRM-MS based on chemical labeling [3]  反相柱以其柱效高、性能稳定等优点而广泛应用于小分子化合物的分离。通过 对强亲水性分析物引入疏水基团既可以增强它在反相色谱柱上的色谱保留，又能 提高检测灵敏度。Rebane等人[4]用FOSF来标记氨基酸。亲水性强的精氨酸和天 冬氨酸在FOSF标记后在C18上的保留显著增加，同时提高了检测灵敏度(图3)。
图3. Labeling reaction of FOSF and amino acids [4] 对于强疏水性化合物则引入亲水基团使其容易在反相柱上洗脱。Zhu等人[5] 利用DMED标记了19种花生四烯酸(arachidonic acid, AA) (图4)。标记产物在反相色谱上的保留较标记前减弱，因此在实现良好分离的同时能够更快洗脱。
图4. Labeling reaction of DMED and AAs [5] 此外，对映异构体在普通色谱柱上难以分开，使用手性试剂对其标记后形成非 对映异构体从而能在普通色谱柱上分离。Zheng等人[6]利用手性试剂金鸡纳碱胺(cinchona alkaloid-derived primary amines, CAPAs)来标记8对内源性手性羧酸对映体，标记产物在普通色谱柱上实现分离 (图5)。
图5. Labeling reaction of DMED and AAs [6]  化学标记结合LC-MS能够提高化合物的检测灵敏度，但在实际样品分析中， 分析物的离子化效率易受共流出物(co-elutes)的影响，这可能导致同一样品不同 批次进样的质谱响应出现差异。因此需要相应的同位素内标来校正信号波动。然而，部分分析物的同位素内标难以获得，同时同位素内标价格昂贵。化学同位素标记（Chemical isotope labeling, CIL）可解决同位素内标缺乏的问题。同位素试剂的结构如图6所示，包括反应基团，易电离基团以及同位素标签。标准品与同位素标记后可作为一对一的同位素内标来获得更为准确的定量结果。例如，Hao等人[7]利用DMED标记水稻叶中的赤霉素，以d4-DMED标记的赤霉素标准品为内标，实现了11种赤霉素的准确定量(图7)。
图6.General structure of isotopic labeling reagents
图7.General procedure for isotopic labeling [7]  化学同位素标记-液相色谱质谱联用技术（CIL-LC-MS）已经广泛应用于非目标代谢组学中，基本流程如下：同位素试剂分别标记两组相同的样品。标记后，“轻重标记的样品”1:1等体积混合进行LC-MS分析。将保留时间一致，分子量之差等于同位素试剂分子量之差的峰对挑选出来，这些峰对即是标记产物。随后，针对这些峰对进行定性与定量研究。化学标记技术应用于代谢组学中有以下优点：(1)引入易电离基团，检测灵敏度提高，提高代谢 物分析的覆盖率；(2)同位素峰对提高选择性，易于排除假阳性信号；(3)同位素标记能实现不同样品之间的相对定量。 武汉大学/武汉纺织大学冯钰锜教授课题组已利用CIL结合中性丢失扫描(neutral loss scan, NLS)/母离子扫描 (precursor ion scan, PIS)的策略能够在低分辨MS如三重四极杆上进行代谢组学分析。如Liu等人[8]利用BQB/d7-BQB标记啤酒中的巯基化合物，BQB标记产物在CID下能产生特征性的m/z 218子离子，对应d7-BQB标记产物产生m/z 225子离子进行LC-MS分析时，MS同时进行两个独立的PIS(PI m/z 218 和 m/z 225)(图8)。分析结束后筛选出两个独立事件中保留时间，强度一致的峰对。然后对帅选的峰对进行定性分析。Zhu等人[9]利用DMED/d4-DMED标记血清中的羧基化合物。DMED/d4-DMED 标记产物在CID下分别产生NL45与NL49(图9)。MS同时进行两个独立的NLS(NL45和NL49)。化学同位素标记-双扫描技术有效地提高了低分辨MS非目标性分析方法的选择性。
图8.General procedure for CIL-PIS of BQB/d7-BQB [8]
图9.General procedure for CIL-NLS of DMED/d4-DMED [9] CIL结合高分辨MS在代谢组学中也有应用。如Guo等人[10]利用12C/13C-丹磺酰氯 (12C/13C-DanCl) 标记尿液中的氨基与酚羟基化合物。标记后筛选包含12C/13C同位素峰的离子对。筛选规则为：Δm=2.0068 ± 0.0001；Δm ≤ 2.4s; 峰强度一致。其中将待测样品用12C-DanCl 标记，标准品用13C-DanCl标记后混合，能够实现绝对定量分析。若混合样品用13C-DanCl标记，则可实现相对定量分析(图10)。此外，该课题组后续建立保留时间校正方法并建立标准化数据库以及定性软件[11]，从而能够实现氨基以及酚羟基化合物的快速定性与定量分析。
图10.General procedure for 12C/13C-DanCl labeling based metabolomics [10] 参考文献： [1] Chen M L, Fu X M, Liu J Q, et al. Highly sensitive and quantitative profiling of acidic phytohormones using derivatization approach coupled with nano-LC–ESI-Q-TOF-MS analysis[J]. Journal of Chromatography B, 2012, 905: 67-74. [2] Liu P, Cai W J, Yu L,etal. Determination of phytochelatins in rice by stable isotope labeling coupled with liquid chromatography–mass spectrometry[J]. Journal of agricultural and food chemistry, 2015, 63(25): 5935-5942. [3] Liu P, Qi C B, Zhu Q F, et al. Determination of thiol metabolites in human urine by stable isotope labeling in combination with pseudo-targeted mass spectrometry analysis[J]. Scientific reports, 2016, 6:21433. [4] Rebane R, Oldekop M L, Herodes K. Comparison of amino acid derivatization reagents for LC–ESI MS analysis. Introducing a novel phosphazene-based derivatization reagent[J]. Journal of Chromatography B, 2012, 904: 99-106. [5] Zhu Q F, Hao Y H, Liu M Z, et al. Analysis of cytochrome P450 metabolites of arachidonic acid by stable isotope probe labeling coupled with ultra high-performance liquid chromatography/mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2015, 1410: 154-163. [6] Zheng J, Zheng S J, Qi C B, et al. 4-Plex Chemical Labeling Strategy Based on Cinchona Alkaloid Derived Primary Amines for the Analysis of Chiral Carboxylic Acids by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry[J]. Analytical Chemistry, 2019, 91(17): 11440-11446. [7] Hao Y H, Zhang Z, Wang L, et al. Stable isotope labeling assisted liquid chromatography–electrospray tandem mass spectrometry for quantitative analysis of endogenous gibberellins[J]. Talanta,2015, 144: 341-348. [8] Liu P, Huang Y Q, Cai W J, et al. Profiling of thiol-containing compounds by stable isotope labelingdouble precursor ion scan mass spectrometry[J]. Analytical chemistry, 2014, 86(19): 9765-9773. [9] Zhu Q F, Zhang Z, Liu P, et al. Analysis of liposoluble carboxylic acids metabolome in human serumby stable isotope labeling coupled with liquid chromatography–mass spectrometry[J]. Journal ofChromatography A, 2016, 1460: 100-109. [10] Guo K, Li L. Differential 12C-/13C-isotope dansylation labeling and fast liquid chromatography/mass spectrometry for absolute and relative quantification of the metabolome[J].Analytical chemistry, 2009, 81(10): 3919-3932. [11] Huan T, Wu Y, Tang C, et al. DnsID in MyCompoundID for rapid identification of dansylated amine and phenol-containing metabolites in LC–MS-based metabolomics[J]. Analytical chemistry, 2015, 87(19):9838-9845. 如有侵权请联系作者删防 转载请在下方留言或联系后台工作人员    上一篇关于鹭珈生物
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